虾蟹类免疫相关基因的研究

【摘要】中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)是我国重要的经济养殖蟹类之一,又俗称河蟹或大闸蟹,隶属于节肢动物门(Athropoda)、软甲纲(Malacostraca)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae)、绒螯蟹属(Eriocheir)、中华绒螯蟹种(Eriocheirsinensis),不仅肉味鲜美,营养丰富,而且是我国久负盛名的美食,因此具有极高的经济和养殖价值。红螯光壳螯虾(Cheraxquadricarinatus),又俗称澳洲淡水龙虾或者红螯螯虾,隶属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、拟螯虾科(Parastacidae)、光壳虾属(Cherax),原产于澳大利亚,于1991年首次引入我国试养,并于次年开展人工繁殖和自然繁殖获得成功,因其具有肉质细嫩、生长速度快、养殖产量高、富含低胆固醇等特点而被广泛推广养殖。伴随着两种甲壳动物养殖规模的扩大以及集约化养殖的发展,各种养殖病害频发,严重制约了这两种甲壳动物养殖产业的发展。而这两种甲壳动物,均凭借其独特的先天性免疫系统,在外界不良生存环境中有效地抵御外界病原菌的入侵,因而其先天性免疫防御机制的研究备受关注。有鉴于此,本研究以这两种甲壳动物为研究对象,开展了对这两种甲壳动物免疫相关基因的功能研究,以期能够完善甲壳动物先天性免疫防御机制的理论研究,为制定有效地病害防御策略提供坚实的理论基础与支持。本研究主要研究内容与结果如下：1)中华绒螯蟹Toll基因的克隆与表达分析Toll样受体在诱导病原菌的先天性免疫应答反应中起着重要作用,因此在大部分昆虫中均已经有所报道,但是在中华绒螯蟹中却未见报道。在本文中,我们克隆了两个新的中华绒螯蟹Toll基因：EsTolll和EsToll2。EsTolll基因的cDNA全长3963bp,开放阅读框3042bp,编码1013个氨基酸。其胞外区主要由17个亮氨酸重复序列组成,胞内区主要由139个氨基酸残基的TIR结构域组成。EsToll2基因cDNA全长4419bp,开放阅读框2667bp,编码888个氨基酸。其胞外区主要由10个亮氨酸重复序列组成,胞内区主要由139个氨基酸残基的TIR结构域组成。聚类分析的结果显示,EsToll1和EsToll2首先与其它甲壳动物的Toll受体家族聚为一支,然后与其它节肢动物的Toll受体家族聚为一支。荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果表明：EsTolll和EsToll2在各组织中都能够检测到,经由脂多糖(LPS)、肽聚糖(PG)和葡聚糖(GLU)免疫刺激后,表达量具有不同程度的变化。比较重要的是,EsToll2mRNA的表达量几乎在所有免疫时间段内均有显著的增加。综上,EsTolll和EsToll2对于不同的病原相关分子的刺激具有不同的可诱导性,对中华绒螯蟹先天性免疫应答的研究具有重要意义。2)中华绒螯蟹Tube基因的克隆与表达分析Tube作为Toll信号通路中的重要组分,在机体存活、发育以及先天性免疫等生理活动中具有重要的作用。目前已经在对虾中被成功识别,但是未见在中华绒螯蟹中有所报道。在本文中,我们成功克隆得到了中华绒螯蟹Tube基因,简称为EsTube。EsTube基因cDNA全长2247bp,开放阅读框1539bp,编码512个氨基酸。EsTube蛋白主要包括一个由116个氨基酸残基组成的死亡结构域(deathdomain,DD)和一个由272个氨基酸残基组成的丝组氨酸蛋白激酶结构域(STKc)。聚类分析的结果显示,EsTube首先与其它无脊椎动物Tube和Tube样蛋白聚为一支,然后与脊椎动物的IRAK-4蛋白聚为一支,最后与其它无脊椎动物Pelle蛋白聚为一支。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的结果显示,EsTube高度表达在卵巢和精巢,中度表达在胸神经节和胃；在所有发育阶段均能检测到EsTube的表达,高度表达在精巢发育的精细胞阶段(十月份)和卵巢发育的Ⅲ-2阶段(十一月份)；在不同病原相关分子模式(LPS、β-1,3-glucanandPG)的免疫刺激下,具有不同的诱导表达水平。综上,本研究的结果表明,EsTube在中华绒螯蟹免疫和发育方面具有重要的作用,具有免疫和发育的双重功能。3)中华绒螯蟹Dorsal基因的克隆与表达分析Dorsal作为Toll信号通路中的重要组分,在先天性免疫应答的诱导和识别中具有重要作用。在本文中,我们在中华绒螯蟹中克隆了一个NF-κB样核转录因子—Dorsal,简称为EsDorsal。EsDorsal基因cDNA全长2493bp,开放阅读框2022bp,编码673个氨基酸。EsDosal蛋白主要包括一个由171个氨基酸组成的RHD结构域和一个由102个氨基酸组成的IPT结构域。聚类分析的结果显示,EsDorsal首先与其它无脊椎动物的Dorsals或者NF-κBs聚为一支,然后与脊椎动物的NF-κBs聚为一支。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的结果显示,EsDorsal在免疫相关组织中表达量较高,经过脂多糖(LPS)、肽聚糖(PG)和葡聚糖(GLU)免疫刺激后,表达量具有不同程度的变化。重要的是,相对于对于肽聚糖(PG)和葡聚糖(GLU),EsDorsal对脂多糖(LPS)的免疫刺激更加敏感。综上,EsDorsal对于不同的病原相关分子的刺激具有不同的可诱导性,对中华绒螯蟹先天性免疫应答机制的研究具有重要意义。4)红螯光壳螯虾Crustin基因的克隆与功能分析抗菌肽作为一种重要的免疫效应因子,对于红螯光壳螯虾(Cheraxquadricarinatus)先天性免疫应答防御反应具有重要作用。本研究综合同源克隆和SMART-RACE技术,从红螯光壳螯虾的血细胞中成功克隆得到了一个重要的抗菌肽Crustin,简称为CqCrustin。CqCrustin基因cDNA全长为608bp,开放式阅读框为324bp,编码107个氨基酸,在其推测的氨基酸序列的N端含有一个由16个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有一个由48个氨基酸残基组成的乳清酸蛋白(WAP)结构域。基于其WAP结构域的序列信息,进行聚类分析的结果显示,CqCrustin首先与其它甲壳动物的Ⅰ型Crustin聚为一支,然后与其它甲壳动物Ⅱ型Crustin聚为一支,最后于Ⅲ型Crustin聚为一支。多序列比对的结果显示,CqCrustin与克氏原螯虾(Procambarusclarkii)PcCrustin2具有较高的序列相似性(69%)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的结果显示,CqCrustin主要表达在免疫相关组织,且在红螯光壳螯虾血细胞中的表达量最高；利用LPS,GLU和PG三种病原相关分子模式免疫刺激后,CqCrustin的mRNA表达水平在红螯光壳螯虾血细胞中具有不同程度的显著上调。为了进一步研究其生物学活性,利用原核表达技术获得的重组蛋白rCqCrustin对于不同的病原菌具有不同程度的结合活性,而且对不同的病原菌的生长速度亦具有不同程度的抑制作用。综上可见,CqCrustin在红螯光壳螯虾先天性免疫识别和防御过程中具有重要作用。5)红螯光壳螯虾Dscam基因的克隆与功能分析细胞粘附分子(Dscam)属于免疫球蛋白超级家族中的重要一员,在无脊椎动物,特别是节肢动物的先天性免疫识别和防御中具有重要作用。本研究综合同源克隆和SMART-RACE技术,从红螯光壳螯虾(Cheraxquadricarinatus)的血细胞中成功克隆得到了其Dscam基因,简称为CqDscam。GqDscam蛋白含有类似于其它无脊椎动物的Dscam蛋白同系物的典型结构域,主要包括一个信号肽、10个免疫球蛋白结构域(Ig)、6个Ⅲ型纤连蛋白结构域(FNⅢ)、一个跨膜区和一个细胞质尾结构域。聚类分析的结果显示,CqDscam蛋白首先与其它甲壳动物的Dscam同系物聚为一支,然后与其它无脊椎动物的Dscam同系物聚为一支,最后与脊椎动物的Dscam同系物聚为一支。胞外结构域的检测结果表明,CqDsccam蛋白的N端具有多个可变剪切亚型,其中Ig2结构域具有30个亚型,Ig3结构域具有33个亚型,Ig7具有19个亚型,跨膜区具有2个亚型,理论上,总共可产生多达37620个不同的亚型。qRT-PCR的检测结果表明,CqDscam组成性表达在红螯螯虾各组织,特别是神经和免疫相关的组织：利用脂多糖(LPS)、肽聚糖(PG)和β-1,3-葡聚糖(GLU)免疫刺激红螯螯虾后,CqDscam的mRNA表达水平具有不同程度的诱导上调。CqDscam重组蛋白的功能检测显示,rCqDscam能够不同程度地识别不同的细菌,并且能够不同程度地抑制革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的生长。此外,免疫荧光的结果显示,CqDscam主要分布于红螯螯虾血细胞的表面。综上可见,CqDscam在红螯螯虾的先天性免疫识别和防御中具有重要作用。
【作者】于爱清；
【导师】王群；
【作者基本信息】华东师范大学，水生生物学，2014，博士
【关键词】中华绒螯蟹；红螯光壳螯虾；先天性免疫；病原相关分子模式；Toll；Tube；Dorsal；Crustin；Dscam；

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